Sequence 1
前情提要（）結束後，玩家／Desmond進入Ezio的一段記憶（Sequence 9），但內容異常混亂。接下來，Ezio的記憶跳回1499年12月的梵蒂岡（《刺客教條2》的尾聲），與「女神」Minerva於西斯汀教堂地窖的相遇。Minerva留下了謎語般的一句話「接下來靠你了...Desmond」後便消失無蹤，滿腹狐疑的Ezio步出地窖，發現先前倒地的教宗亞歷山大六世／Rodrigo Borgia已逃之夭夭，他的權杖也自動封入地底。
這時Ezio的叔叔Mario正好趕來，待Ezio爬出地窖（按住Y鍵不放打開Eagle Vision可看到攀爬點）後，兩人一同離開梵蒂岡。來到河畔，Ezio不知是否該把依甸殘片之一的蘋果丟入河裡，猶豫許久後，Mario要Ezio先把蘋果交給他，之後再處理。
